Nanopore納米孔測(cè)序技術(shù)

      納米孔測(cè)序技術(shù)如今飛速發(fā)展。以Nanopore納米測(cè)序儀為例，它在Nanopore芯片的基質(zhì)上錨定一個(gè)“孔道蛋白”，該蛋白可以和“motor蛋白”結(jié)合。“motor蛋白”可以將DNA雙螺旋解開成單鏈，并控制單鏈通過(guò)“孔道蛋白”。當(dāng)DNA單分子穿過(guò)“孔道蛋白”時(shí)，不同的堿基會(huì)帶來(lái)不同的電流變化，孔道中的感受器能夠感知這種變化。根據(jù)電流變化的頻譜，應(yīng)用模式識(shí)別算法得到堿基序列
（圖1）。

圖1 納米孔測(cè)序原理示意圖。DNA分子被motor蛋白解螺旋后通過(guò)孔道蛋白，產(chǎn)生電流變化。

     儀器特點(diǎn)：
• 實(shí)時(shí)讀取堿基序列，不需要后期集中對(duì)測(cè)序信號(hào)進(jìn)行二次解讀
• DNA/RNA直接測(cè)序，RNA不需要經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄再測(cè)序
• 超長(zhǎng)讀長(zhǎng)，可以達(dá)到“M bp”級(jí)別
• 高保真度，因?yàn)椴恍枰M(jìn)行PCR擴(kuò)增，避免了引入突變
• 可以檢測(cè)堿基修飾
      特點(diǎn)展示1：實(shí)時(shí)測(cè)序
    “Motor蛋白”有兩個(gè)作用，一個(gè)是將捕獲的DNA分子進(jìn)行解螺旋，變成單鏈分子；另一個(gè)是控制單鏈分子進(jìn)入納米孔的速度。當(dāng)DNA分子上不同的堿基通過(guò)納米孔時(shí)，會(huì)產(chǎn)生不同的電流變化，這種變化被實(shí)時(shí)記錄下來(lái)，然后快速進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和匹配，從而解析出對(duì)應(yīng)的堿基類型（圖2）。目前的測(cè)序速度可以達(dá)到，DNA 450bp/秒，RNA 70nt/秒。

圖2 納米孔測(cè)序儀對(duì)堿基序列的實(shí)時(shí)解讀。

      特點(diǎn)展示2：納米孔測(cè)序直接解讀RNA中修飾核苷酸
      傳統(tǒng)的rRNA基因或rRNA cDNA拷貝的高通量測(cè)序（二代測(cè)序，方法是SBS）已廣泛用于系統(tǒng)發(fā)育研究和臨床鑒定傳染性生物。然而，通過(guò)“邊合成邊測(cè)序（SBS）”的方法移除了rRNA的表觀遺傳修飾信息。納米孔測(cè)序的一個(gè)顯著優(yōu)勢(shì)，是可對(duì)天然DNA和RNA進(jìn)行直接分析并解析堿基修飾。這種直接RNA測(cè)序技術(shù)有望快速鑒定環(huán)境和患者樣本中的微生物。

圖3 納米孔測(cè)序儀直接測(cè)序RNA。RNA修飾可以作為微生物鑒定的指標(biāo)，同時(shí)納米孔測(cè)序儀的長(zhǎng)讀長(zhǎng)可以幫助提高分類準(zhǔn)確性。

      應(yīng)用領(lǐng)域：
      納米孔測(cè)序儀憑借其超長(zhǎng)讀長(zhǎng)、便捷的建庫(kù)、實(shí)時(shí)測(cè)序、能進(jìn)行表觀遺傳分析等諸多優(yōu)點(diǎn)，在測(cè)序領(lǐng)域逐漸得到廣泛的應(yīng)用。目前，在微生物耐藥性/致病性，微生物宏基因組，人類遺傳學(xué)研究，癌癥研究，轉(zhuǎn)錄組分析等領(lǐng)域，Nanopore測(cè)序儀正帶來(lái)越來(lái)越多的研究成果。
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